Aislamiento de Microorganismos en Agar Papa Dextrosa

El agar papa dextrosa (APD), también conocido como Potato Dextrose Agar (PDA) o agar glucosado de papa, es un medio de cultivo nutritivo sólido y no selectivo, ampliamente utilizado en microbiología. Su uso está indicado especialmente para el aislamiento de hongos filamentosos y levaduras. En este medio pueden crecer especies bacterianas y fúngicas, sin embargo, es particularmente útil para el aislamiento de hongos fitopatógenos, es decir, aquellos que afectan a los vegetales. Como ejemplo, se puede observar el crecimiento de colonias de Uncinocarpus reesii en agar papa dextrosa.

Características y Composición del Agar Papa Dextrosa

El medio papa dextrosa es un medio muy sencillo y fácil de preparar en el laboratorio. Contiene, como su nombre lo indica, infusión o extracto de papa, dextrosa y agar-agar. La combinación de la infusión de papa con la glucosa proporciona la fuente de energía perfecta y los nutrientes esenciales (carbohidratos, vitaminas y minerales) para un crecimiento satisfactorio de los hongos.

El pH del medio queda en 5,6 ± 0,2. El medio por sí solo no inhibe el crecimiento de las bacterias, por tanto, es un medio no selectivo, aunque su pH ligeramente ácido favorece el desarrollo fúngico. Las levaduras y los mohos metabolizan la dextrosa como fuente de energía, produciendo ácido y reduciendo el pH del medio, lo que puede causar un cambio de color en el indicador a amarillo en un ambiente ácido, permitiendo la detección visual de colonias fúngicas. El APD fue desarrollado originalmente por Reddish en 1919 y estandarizado por la USP en 1950.

Aplicaciones Principales del APD

El agar papa dextrosa es un medio de cultivo versátil y ampliamente utilizado para la identificación, cultivo y enumeración de levaduras y mohos en diversas áreas.

Usos Generales y Específicos

• Se utiliza para el recuento de colonias fúngicas en muestras de cosméticos, productos farmacéuticos y algunos alimentos lácteos.
• También se emplea para determinar la carga de hongos y levaduras presentes en muestras vegetales, alimentos, cosméticos o fármacos.
• En la industria alimentaria, es crucial para el análisis microbiológico, detectando la presencia de levaduras y mohos que puedan indicar deterioro o contaminación, principalmente en los lácteos.
• El APD tiene aplicaciones en la industria, la clínica, la agricultura, la microbiología ambiental y la investigación científica.

Microorganismos Comunes en APD

En el agar papa dextrosa (APD), se pueden encontrar una variedad de hongos, levaduras y mohos, cuya presencia puede indicar contaminación, deterioro o problemas de calidad en los alimentos:

• Aspergillus spp.: Diferentes especies como Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Aspergillus fumigatus.
• Fusarium spp.: Hongos que pueden contaminar granos y productos derivados de cereales.
• Saccharomyces spp.: Algunas especies de levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, utilizadas en la fermentación de alimentos.
• Rhizopus spp.: Mohos que pueden contaminar frutas y vegetales frescos, así como productos envasados.
• Mucor spp.: Especies que pueden crecer en alimentos con alto contenido de azúcar.

Preparación del Medio Agar Papa Dextrosa

La preparación del agar papa dextrosa puede realizarse a partir de sus componentes básicos o utilizando medio deshidratado comercial.

Preparación a partir de Componentes Básicos (Método Tradicional)

1. Se lavan muy bien las papas, quitando la tierra que posean, y se cortan en rodajas finas con todo y piel.
2. El líquido obtenido de la cocción se filtra a través de una gasa y se completa con agua destilada hasta llegar a un litro.
3. Se añaden 20 g de dextrosa y 15 g de agar en polvo a este caldo filtrado.
4. La mezcla se calienta, agitando frecuentemente hasta su disolución total.
5. Posteriormente, se esteriliza en autoclave.
6. Dejar enfriar hasta 50 °C y servir en placas de Petri estériles. Para preparar cuñas, se colocan de 12 a 15 ml del medio en tubos antes de autoclavar, y al salir del autoclave se acuestan en soportes especiales hasta que solidifique.

Preparación a partir de Medio Deshidratado Comercial

1. Pesar 39 g del medio deshidratado disponible comercialmente.
2. Disolverlo en un litro de agua destilada.
3. La mezcla se calienta agitando frecuentemente hasta su disolución total.
4. Se esteriliza en autoclave.
5. Después de la esterilización, el medio se puede verter en placas de Petri estériles o en tubos para cuñas.

Toma de Muestra y Siembra en APD

La toma de muestra y la siembra adecuadas son esenciales para un aislamiento exitoso de microorganismos.

Para Hongos Fitopatógenos de Vegetales

1. En un vaso de 50 cc con alcohol al 50%, colocar los trozos de las hojas (pedazos manchados y sanos) para desinfectar la superficie por 20 a 30 segundos.
2. Tomar con una pinza estéril los pedacitos desinfectados y colocarlos en la superficie del medio (un máximo de 10 pedazos por placa).

Para Dermatofitos y Muestras Clínicas

• La toma de muestra para buscar dermatofitos se debe hacer usando una hoja de bisturí Nº 11, bien sea para cortar cabello afectado, escamas de la piel o uñas.
• Dependiendo de la patología, puede cortarse la parte afectada o arrancados de raíz, o realizar raspados o cortar una parte específica de la uña afectada.
• En lesiones exudativas, la muestra se toma con torunda seca o húmeda.
• Otro método de toma de muestra es a través de la técnica del cuadrado de moqueta de Mariat y Adán Campos.

Las muestras deben sembrarse inmediatamente sobre el agar papa dextrosa o agar Sabouraud.

Cuantificación de Hongos y Levaduras

Para la determinación de la carga de hongos y levaduras en diversas muestras, se sigue un procedimiento específico:

1. Verter 1 ml de la muestra -preferiblemente diluida- en una placa de Petri estéril y vacía.
2. Fundir un taco de agar papa dextrosa y dejar enfriar a 45 °C.
3. Verter sobre la placa de Petri y rotar hasta homogenizar la muestra con el medio.
4. Incubar en aerobiosis:
   • Para mohos: a 20-25 °C.
   • Para levaduras: a 30-32 °C.
   La incubación se realiza por 5 a 7 días o más, dependiendo del tipo de hongo que se busca y el tipo de muestra.

Control de Calidad y Conservación de Cultivos

La preparación correcta del Agar Papa Dextrosa según estándares internacionales y regulaciones, como USP 43-NF 38, ISO 11133:2014, CLSI M38-A2, y la European Pharmacopoeia, es fundamental para obtener resultados confiables y reproducibles.

Control de Calidad del Medio

• De cada lote preparado, se deben tomar 1 o 2 placas e incubarlas a 25 °C por 48 horas o a 20 °C por 96 horas para verificar su esterilidad y capacidad de soporte de crecimiento.
• Para el control de crecimiento, se utilizan cepas estándar como Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 y Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533.

Conservación de Cultivos Fúngicos

Para la preservación a largo plazo de hongos, se cultiva el microorganismo en cuñas de agar papa dextrosa. Una vez que el hongo ha crecido, este se cubre con aceite mineral. Es esencial que el aceite sea esterilizado en autoclave por 45 minutos y tenga una viscosidad aproximada de 300 a 330 Saybolt.

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