Todos los seres vivos contienen miles de proteínas con estructura y funciones muy diferentes. Muchas de estas proteínas se utilizan como productos terapéuticos en sanidad humana y animal, como vacunas, o en las industrias alimentaria, textil o química. La obtención a gran escala y de forma segura de estas proteínas a partir de productos naturales es en ocasiones muy difícil. Sin embargo, en las últimas décadas, gracias a la aplicación de las técnicas de ingeniería genética que permiten la manipulación del ADN, hemos sido capaces de producir proteínas recombinantes.
Las proteínas recombinantes son aquellas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética en células distintas a las que las producen en la naturaleza. Para obtener estas proteínas, el gen que codifica la proteína de interés se introduce en un plásmido bacteriano para facilitar su manejo y, a partir de ahí, se transfiere a las células que van a "fabricar" la proteína. Hoy en día, las proteínas recombinantes se usan en muchos procesos, incluso de la vida diaria, incluyendo productos terapéuticos como la insulina, la renina para la producción de quesos, la somatotropina bovina para estimular la producción de leche, y proteasas en detergentes para eliminar manchas.
En los laboratorios se trabaja con distintos sistemas de expresión de proteínas recombinantes, basados en microorganismos y líneas celulares que son fáciles de cultivar. La expresión en la bacteria E. coli es uno de los más utilizados, por su fácil manejo y elevado rendimiento. No obstante, al tratarse de un sistema de expresión procariota, las proteínas expresadas en bacterias a veces presentan una estructura y funcionalidad tan diferente a la nativa que no pueden ser utilizadas, especialmente cuando se buscan proteínas humanas o de microorganismos que en la naturaleza se sintetizan en células eucariotas. La primera proteína recombinante que se produjo y comercializó fue la insulina humana (conocida como Humulina), aprobada por la FDA en 1982. Otros ejemplos incluyen el interferón humano para el tratamiento de la esclerosis múltiple, el factor VIII de la coagulación contra la hemofilia y la hormona del crecimiento.
Las Levaduras como Sistemas de Expresión Recombinante
Las levaduras tienen una amplia aplicación en la biotecnología y son los microorganismos más utilizados en la investigación médica y en la industria. Uno de sus usos tradicionales es la fermentación, mediante la cual se pueden obtener bebidas, alimentos y proteínas, entre otros productos. Desde principios de 1980, las levaduras han sido utilizadas para la producción a gran escala de proteínas intracelulares y extracelulares de humanos, animales y plantas.
Los sistemas de expresión de proteínas recombinantes basados en levaduras han demostrado ser una fuente eficiente y económica de proteínas de interés industrial y académico, convirtiéndose en una de las alternativas más utilizadas para la producción a gran escala. Las levaduras como sistemas de producción de proteínas recombinantes presentan las ventajas de los organismos unicelulares, como su práctica manipulación genética y rápido crecimiento, así como la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales eucariotas. Estas incluyen el procesamiento proteolítico, el plegamiento, la formación de puentes disulfuro y la glicosilación.
En comparación con modelos de expresión de proteínas en organismos eucariotas más complejos, como células de ovarios de hámster chino o líneas celulares infectadas de baculovirus, las levaduras son más económicas, generalmente presentan mayores rendimientos, no contienen pirógenos y son menos demandantes en términos de tiempo y esfuerzo. Sin embargo, una de las desventajas de las levaduras en la producción de proteínas heterólogas es su incapacidad para realizar ciertas modificaciones postraduccionales específicas, como la prolil-hidroxilación y la amidación.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes de interés industrial o medicinal. Algunos ejemplos de proteínas producidas en S. cerevisiae incluyen la insulina humana y vacunas para el virus de la hepatitis y el virus del papiloma humano. El mejoramiento de los sistemas de expresión en levaduras, junto con la metodología de hibridación, ha permitido un aumento significativo en el uso de levaduras para la producción de proteínas.
Pichia pastoris (Komagataella phaffii): Un Sistema de Expresión Prometedor
La levadura metilotrófica Pichia pastoris (clasificada actualmente como Komagataella phaffii) es una de las más importantes para la producción de proteínas heterólogas. La habilidad de ciertas levaduras de utilizar metanol como única fuente de carbono y energía se descubrió hace aproximadamente 40 años. Aunque inicialmente el interés se centró en su uso para la producción de biomasa y proteína unicelular para la alimentación animal, Pichia pastoris se ha convertido en una poderosa herramienta biotecnológica como modelo de células eucariotas para la biología celular y la producción de proteínas recombinantes.
La expresión de proteínas en Pichia pastoris mediante la tecnología del ADN recombinante ha crecido vertiginosamente. El primer biofarmacéutico expresado en esta levadura y aprobado por la FDA en 2009 fue Kalbitor®, indicado para el tratamiento del angioedema hereditario. Además, P. pastoris se ha aplicado con éxito en la producción de vacunas en Cuba, como la vacuna contra la hepatitis B y una vacuna para el control de garrapatas.
Base Metabólica y Promotores
La base conceptual del sistema de expresión de Pichia pastoris reside en la observación de que algunas de las enzimas necesarias para el metabolismo del metanol se presentan en niveles sustanciales solo cuando las células se cultivan con esta fuente de carbono. La enzima AOX (alcohol oxidasa) cataliza el primer paso en la ruta de utilización de metanol, oxidándolo a formaldehído y peróxido de hidrógeno. Esta enzima, junto con la catalasa, se secuestra dentro del peroxisoma. Dos de las enzimas de la ruta del metanol, AOX y DHAS (dihidroxiacetona sintasa), están presentes a niveles elevados en células cultivadas en metanol, pero no en otras fuentes de carbono como glucosa, glicerol o etanol.
El éxito de Pichia pastoris como plataforma de producción se basa principalmente en el promotor fuerte y estrictamente regulado del gen AOX1, que representa el 90% de la actividad total de alcohol oxidasa. Este promotor se reprime en presencia de glucosa, glicerol y etanol, y se induce fuertemente en presencia de metanol. A pesar de sus ventajas, la expresión basada en el promotor AOX1 presenta inconvenientes, como el riesgo de incendio por el metanol, su inviabilidad en procesos alimentarios y la dificultad en su monitoreo en línea.
Para reducir el uso de metanol, se han desarrollado promotores alternativos a AOX1. Ejemplos incluyen el promotor de la enzima formaldehído deshidrogenasa (FLD), el promotor constitutivo del gen de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAP) y el promotor del factor de alargamiento de la traducción constitutiva 1-α (TEF1), que han mostrado rendimientos comparables o incluso mayores que el promotor AOX1 en ciertas condiciones.
Expresión génica: es como seguir una receta: Crash Course Biología #36
Cepas, Vectores y Métodos de Transformación
Todas las cepas de expresión de Pichia pastoris derivan de la cepa de tipo salvaje NRRL-Y 11430. Existen tres tipos de cepas hospederas que difieren en su capacidad para metabolizar el metanol: el fenotipo Mut+ (cepa salvaje, crece más rápido en metanol), Muts (lenta utilización de metanol por eliminación del gen AOX1) y Mut- (incapaz de crecer en metanol por eliminación de AOX1 y AOX2). La cepa GS115 (Mut+) se usa principalmente para producciones de proteínas recombinantes.
Se han desarrollado muchos vectores de expresión para Pichia pastoris, que suelen ser vectores lanzadera de Escherichia coli/Pichia pastoris. Estos contienen un origen de replicación para el mantenimiento del plásmido en E. coli, así como marcadores seleccionables para ambos organismos. La mayoría incluye un sitio de clonación múltiple para la inserción de una secuencia de codificación heteróloga, flanqueada por secuencias promotoras y de terminación, usualmente derivadas de AOX1.
Las manipulaciones genéticas moleculares en Pichia pastoris, como la transformación mediada por ADN, la selección de genes y la clonación, son similares a las descritas para otras levaduras como Saccharomyces cerevisiae. Pichia pastoris puede transformarse por electroporación con una alta frecuencia, o mediante el método clásico del cloruro de litio y polietilenglicol, aunque con menor rendimiento.
Marcadores Seleccionables y Señales de Secreción
Para la selección de cepas transformadas, se han desarrollado varios marcadores seleccionables, incluyendo marcadores biosintéticos de la vía de histidina (HIS1, HIS2, HIS4, HIS5, HIS6), arginina (ARG1, ARG2, ARG3, ARG4) o uracilo (URA3, URA5). También se pueden usar marcadores basados en genes bacterianos resistentes a antibióticos, aunque esto implica la integración de genes de resistencia bacteriana, lo que podría representar un peligro potencial de diseminación al medio ambiente. Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado un marcador de amplificación basado en el gen FLD1, aprovechando la capacidad de Pichia pastoris para metabolizar metanol y ciertas aminas alquiladas.
La secreción de proteínas en Pichia pastoris requiere el uso de señales peptídicas que dirigen las proteínas recombinantes a través de la ruta secretora. Las más utilizadas son el factor α prepro-péptido de Saccharomyces cerevisiae o las señales de fosfatasa ácida de Pichia pastoris (PHO1). Otras señales de secreción, como las de Rhizopus oryzae α-amilasa, Trichoderma reesei clase 2 hidrofobinas, y señales peptídicas endógenas de Pichia pastoris (PIR1, SCW, DSE, EXG) también se han utilizado con éxito.
Glicosilación en Pichia pastoris
En contraste con las bacterias, las levaduras son capaces de producir proteínas glicosiladas. Sin embargo, los patrones de glicosilación en levaduras difieren de los de eucariotas superiores. Pichia pastoris puede añadir restos de carbohidratos ligados a O y N a proteínas secretadas. Los O-oligosacáridos en Pichia pastoris se componen de residuos de manosa, a diferencia de los mamíferos donde se componen principalmente de ácido siálico, galactosa y N-acetilgalactosamina. Además, Pichia pastoris no tiene aminoácidos preferidos para la O-glicosilación, y la ausencia de ácido siálico en las glicoproteínas puede llevar a su rápida eliminación del torrente sanguíneo, lo que puede ser una desventaja para algunas aplicaciones terapéuticas.
Impacto de la Temperatura y Levaduras Termotolerantes en la Producción de Proteínas Recombinantes
La temperatura de crecimiento de las levaduras es un factor importante que afecta el plegado correcto de las proteínas recombinantes. Se ha reportado que la capacidad de plegamiento del retículo endoplasmático (RE) y la viabilidad de la cepa GS115 de Pichia pastoris se mantienen a 20°C, permitiendo altas producciones de proteínas como la interleucina-10 humana (rhIL-10). Sin embargo, a 30°C, el RE de la levadura puede sufrir estrés, lo que resulta en la retención de proteínas inmaduras, daño en la capacidad de plegamiento del RE, y una disminución en la viabilidad celular y la producción de la proteína recombinante.
Como alternativa a este problema, se ha sugerido que las levaduras termotolerantes podrían producir proteínas termotolerantes, ofreciendo ventajas sobre las proteínas producidas por otros microorganismos termotolerantes no eucariotas. Por ejemplo, la proteína recombinante fitasa obtenida en P. pastoris ha demostrado una mayor termotolerancia en comparación con la obtenida de otros sistemas de expresión, conservando un porcentaje significativo de su estabilidad en condiciones de alta temperatura.
tags: #obtencion #de #proteinas #recombinantes #en #levaduras