Los medios de cultivo desempeñan un papel primordial en el diagnóstico clínico de enfermedades y en la higiene alimentaria. Los nuevos microorganismos reconocidos como agentes patógenos exigen mayores requisitos respecto a la especificidad y sensibilidad de diagnóstico, por lo que se hace difícil lograr un producto para la caracterización rápida e identificación de estos. Es esencial, por ello, el uso de medios de cultivo primarios adecuados y de respuesta rápida, para lograr así el aislamiento óptimo de los microorganismos.
El agar manitol salado es un medio selectivo usado para el aislamiento de estafilococos patógenos, especialmente Staphylococcus aureus, considerado un patógeno bacteriano serio desde que desarrolló resistencia a la penicilina en 1950. Este medio ha sido empleado también en estudios de resistencia a antibióticos, en los cuales ha demostrado una especificidad de 98,1 % y una sensibilidad de 95,1 % con cepas de Staphylococcus oxacillina resistentes.
Composición y Funcionamiento del Agar Manitol Salado
El agar manitol salado incluye en su composición el indicador de pH: rojo fenol. Este indicador es de color rojo a pH 8,2 y cambia a amarillo a pH por debajo de 6,8. Cuando se desarrollan las colonias de Staphylococcus aureus fermentadoras de manitol, se produce ácido en el medio, el cual reacciona con el indicador y forma las áreas de color amarillo alrededor de las colonias, reacción característica de los estafilococos patógenos.
Sin embargo, la alta concentración del indicador puede afectar la calidad del medio de cultivo porque la mayoría de estos indicadores son tóxicos para los microorganismos. Además, la cantidad excesiva de indicador sulfoftaleínico (como el rojo fenol) proporciona al medio de cultivo una capacidad de buffer adicional y disminuye la difusión de los ácidos metabólicos. Por otra parte, es necesario que el medio de cultivo posea una adecuada composición de bases nutritivas para contrarrestar el efecto inhibitorio de la alta concentración de cloruro de sodio y lograr una rápida y eficiente recuperación de estafilococos.
Modificación y Optimización del Medio
Por todo lo anteriormente mencionado y en respuesta a las exigencias actuales del diagnóstico microbiológico, se decidió realizar modificaciones a la formulación original del medio agar manitol salado, buscando mayor velocidad en la identificación.
Métodos de Optimización
Las variables para la optimización de la formulación del medio fueron la composición de bases nutritivas y la concentración de colorante. Para realizar las diferentes variantes a escala experimental se emplearon bases nutritivas obtenidas en BioCen (Cuba) e ingredientes de QueLab (Canadá) (D-manitol, cloruro de sodio, rojo fenol, agar), además del medio de referencia: agar manitol salado QueLab (lote: 23181743) y agar para conteo en placa QueLab (lote: 21071742).
Se evaluaron 5 variantes experimentales de bases nutritivas:
| Ingredientes | Composición (g/L) | V1 | V2 | V3 | V4 | V5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Peptona Z | 10,0 | 6,5 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Triptona | - | 6,5 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Extracto de levadura | - | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Extracto de carne | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Peptona de sangre | - | - | 5,0 | - | - | - |
| Peptona pancreática de corazón I | - | - | - | 5,0 | - | - |
| Peptona pancreática de corazón II | - | - | - | - | 5,0 | - |
| Cloruro de sodio | 75,0 | 70,0 | 70,0 | 70,0 | 70,0 | 70,0 |
Evaluación Microbiológica
En la evaluación microbiológica de las variantes experimentales se usaron cepas certificadas de la American Type Culture Collection (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y como control negativo Escherichia coli ATCC 25922) y, además, una cepa salvaje de Staphylococcus saprophyticus. Los métodos de inoculación empleados fueron el de estría en ángulo recto e inundación de la superficie. Las diluciones empleadas en la inoculación del medio fueron: 10-6 para Staphylococcus aureus y Staphylococcus saprophyticus, y 10-5 para Staphylococcus epidermidis.
Se analizó el crecimiento de los microorganismos en el tiempo midiendo la densidad óptica, por el método espectrofotométrico a 640 nm. El número de bacterias en las suspensiones inoculadas fue determinado mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) desarrolladas en las placas. Para el análisis estadístico se empleó la prueba de rangos múltiples con un nivel de confianza de 95 %, para comparar la diferencia entre las medias de los recuentos microbianos.
Determinación Espectrofotométrica del Colorante
Se realizó la determinación espectrofotométrica de la concentración óptima del colorante rojo fenol en el medio agar manitol salado. Los valores de absorbancia fueron medidos a 430 nm, lo que corresponde al valor máximo de absorbancia para el colorante estudiado. Como blanco se utilizó el medio líquido (sin agar y sin colorante) manitol salado. La concentración óptima del indicador de pH fue seleccionada a partir de diferentes variantes del medio agar manitol salado líquido utilizando las concentraciones de rojo fenol siguientes: 0,005 g/L; 0,15 g/L; 0,025 g/L; 0,035 g/L y 0,050 g/L.
Resultados de la Optimización
Con la ayuda de las variantes experimentales se obtuvo el valor óptimo del indicador rojo fenol (0,0083 g/L). Paralelamente se realizaron las curvas de crecimiento de 5 variantes de mezclas de bases nutritivas para lograr definir aquella que proporciona la mayor cantidad de nutrientes y permite la rápida recuperación de las cepas de interés (Staphylococcus). El análisis estadístico realizado a los valores de absorbancia obtenidos en las curvas arrojó que la mejor variante fue la variante 4.
Producción Piloto y Evaluación del Nuevo Producto
Teniendo en cuenta la composición de la variante 4 y la cantidad de rojo fenol óptima, se elaboró un lote a escala piloto (9P1) de 1 kg. La evaluación fisicoquímica, organoléptica y microbiológica realizada al nuevo producto utilizando como elemento comparativo el lote 8P1 existente y el medio de referencia de la firma Quelab (lote 23181743) resultó satisfactoria y confirmó el éxito obtenido en el desarrollo de la nueva variante.
El nuevo producto cumple con los requisitos de la calidad establecidos.
| Característica | Var. BioCen (8P1) | Var. BioCen (9P1) | QueLab (medio de referencia) | Requisitos | |
|---|---|---|---|---|---|
| Características organolépticas | Color | beige rosado | beige | beige | beige a beige rosado |
| Apariencia | polvo fino, homogéneo, fluido, sin presencia de grumos o partículas extrañas insolubles | polvo fino, homogéneo, fluido, sin presencia de grumos o partículas extrañas insolubles | |||
| Pérdida por desecación | 2,99 | 1,81 | - | < 7,0 | |
| Nitrógeno total | 1,46 | 1,64 | 1,61 | - | |
| Nitrógeno amínico | 0.48 | 0,63 | 0,74 | - | |
| pH | 7,13 | 7,44 | 7,22 | 7,4 ± 0,2 | |
Evaluación Microbiológica Comparativa
Los resultados de la evaluación microbiológica de los medios agar manitol salado existente (8P1), modificado (9P1) y el agar para conteo en placa se detallan a continuación:
| Microorganismo | Medio de cultivo | Cantidad de UFC/mL (Media ± DE) | Tamaño de las colonias |
|---|---|---|---|
| Staphylococcus aureus ATCC 25923 | BioCen 8P1* | 80 ± 40,0 | 0,8 mm |
| BioCen 9P1* | 160 ± 15,0 | 1,0 mm | |
| APCP * | 63 ± 22,5 | 2,0 mm | |
| Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 | BioCen 8P1 | 790 ± 41,0 | 0,6 mm |
| BioCen 9P1 | 900 ± 21,5 | 0,9 mm | |
| APCP | 855 ± 160,5 | 1,0 mm | |
| Staphylococcus saprophyticus (salvaje) | BioCen 8P1 | 165 ± 23,5 | 0,8 mm |
| BioCen 9P1 | 200 ± 36,0 | 1,0 mm | |
| APCP | 205 ± 35,5 | 1,5 mm | |
| DE: desviación estándar, APCP: agar para conteo en placa, *: existen diferencias significativas entre las variantes (p> 0,05). | |||
Los índices relativos de crecimiento (IRC) de las variantes nueva y la anterior del agar manitol salado de BioCen respecto al medio de referencia fueron determinados para una comparación más representativa de las medias de los valores obtenidos de la cantidad total de colonias recuperadas al inocular los medios de cultivo estudiados. Los IRC de la cepa S. aureus ATCC 25923 respecto a un medio de cultivo de propósito general (agar para conteo en placa) fueron 123 % para la formulación existente de agar manitol salado de BioCen y 246 % para la variante optimizada. En caso de S. saprophyticus los ICR resultaron 81 y 95 %, y para S. epidermidis de 92 y 105 %, respectivamente.
Discusión y Conclusiones
La modificación del medio agar manitol salado utilizando diferentes cepas permitió caracterizar y enfatizar el objetivo de diseño del producto, el cual es ampliamente empleado en la identificación de estafilococos patógenos. El diagnosticador modificado posee cualidades superiores, como rapidez en la visibilidad de las reacciones (cambio del color del medio a amarillo) de degradación del manitol a ácido y menor toxicidad para los microorganismos, pues el valor final del contenido del indicador de pH utilizado resultó ser 3 veces menor que el anteriormente utilizado en el agar manitol salado (BioCen, 8P1).
Además, teniendo en cuenta el precio elevado de los colorantes en el mercado internacional, la nueva formulación resulta ser más beneficiosa en cuanto a su costo de producción. Se debe señalar también el elevado contenido nutricional del nuevo producto, el cual posee los valores de contenido de nitrógeno amínico y total significativamente superiores que el análogo anterior. Por otra parte, no existe diferencia significativa (p<0,05) en valores de estos parámetros entre la variante 9P1 y el medio de referencia de Quelab.
Igualmente se observó que tanto el tamaño de las colonias como la formación del halo de fermentación a su alrededor fueron mayores en el agar manitol salado optimizado (9P1) en comparación con la formulación ya existente. El análisis estadístico comprobó que no existen diferencias significativas (p<0,05) en la recuperación de S. saprophyticus y S. epidermidis; sin embargo, para S. aureus sí se observa diferencia en los medios evaluados, siendo el valor de la media de UFC/mL de la variante 9P1 mayor tanto en comparación con la 8P1 como con el medio agar para conteo en placa.
En conclusión, la modificación de un diagnosticador, aun cuando sea una investigación costosa, permite ofrecer un producto con una calidad superior y brinda seguridad al cliente en cuanto al propósito diagnóstico del medio de cultivo.
