Análisis de Pigmentos de Espinaca mediante Cromatografía

Introducción a la Cromatografía

La cromatografía es un procedimiento físico de división basado en la diferencia de repartición de los elementos de una mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil y una fase estacionaria. Las moléculas del soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y arrastradas por la fase móvil. De esta forma, si los elementos de la mezcla muestran diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de desarrollo en todo el sistema serán diferentes.

Esta técnica versátil permite la separación de mezclas, la purificación de productos, la determinación del nivel de pureza de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la detección y caracterización de compuestos. La cromatografía puede llevar a cabo dos funcionalidades primordiales: dividir los elementos de la mezcla para obtenerlos más puros y utilizarlos posteriormente, y medir la cantidad de los elementos de la mezcla, para lo cual se emplean porciones de material muy pequeñas.

La cromatografía es un instrumento potente para la separación de líquidos o gases de diversas mezclas. Nació a principios del siglo pasado con el objetivo de extraer pigmentos específicos a partir de compuestos de origen vegetal. Su relevancia ha crecido en la industria farmacéutica, donde se demandan altos índices de pureza en los productos, lo que ha generado un gran interés por esta técnica en los últimos años.

Tipos de Cromatografía Aplicados

Para el desarrollo de la cromatografía, se introduce una fase estacionaria o sólida en una columna cilíndrica. Posteriormente, se añade la mezcla (soluto) a descomponer, seguida de un solvente o fase móvil que la conduce a lo largo de la columna.

Cromatografía de Adsorción en Columna (CC)

La cromatografía de adsorción en columna (CC) es una técnica de purificación que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla. Utiliza una columna de vidrio de forma vertical que se rellena con la fase estacionaria, siendo el gel de sílice y la alúmina algunos de los más utilizados. La muestra a separar se coloca en la parte superior del soporte. El resto de la columna se rellena con el disolvente que forma la fase móvil, el cual se mueve a través de la columna por acción de la gravedad. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente de la fase móvil que fluye por la columna (Rodríguez, V., & Alexander, A. 2020).

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

En la cromatografía de adsorción en capa fina (TLC), la fase estacionaria se presenta como una capa delgada de un adsorbente, como gel de sílice, alúmina o celulosa, depositada sobre un soporte plano, como una lámina de aluminio, vidrio o plástico. La TLC es una técnica analítica cuyo objetivo es el análisis de una mezcla de compuestos. El proceso es muy similar a la cromatografía de papel, con la ventaja de que se desarrolla más rápidamente, ofrece mejores separaciones y permite elegir entre distintos adsorbentes. La TLC es una técnica modelo en los laboratorios de química bioorgánica (Esp, J. A. V. R. M. 2020).

Pigmentos Vegetales en la Espinaca

Las hojas de espinaca contienen una serie de productos naturales importantes, incluyendo carotenos, clorofilas, xantofilas y vitaminas hidrosolubles. El color verde característico de la espinaca se debe principalmente a las clorofilas, que son pigmentos fotosintéticos. Sin embargo, la espinaca alberga un gran número de compuestos con estructuras muy distintas que contribuyen a su coloración final.

Clorofilas

Las clorofilas son los pigmentos fotosintéticos de las plantas, responsables de capturar la energía luminosa del sol para producir alimentos en organismos fotoautótrofos. Los cloroplastos deben su color verde a este pigmento, que absorbe todas las longitudes de onda de la luz excepto la verde, que es la que se refleja.

• Clorofila a: Es el tipo de clorofila más distribuida en plantas y algas. Es un pigmento verdoso y su estructura se basa en una porfirina y una cadena de fitol.
• Clorofila b: También presente en plantas y algas verdes, ayuda a la clorofila a en la recolección y transferencia de energía. Es similar a la clorofila a en color y estructura, con la diferencia de que un grupo metilo en la clorofila a es reemplazado por un grupo -CHO en la clorofila b.

La pérdida del ion Mg++ en las clorofilas puede llevar a la formación de feofitina (a y b), que adquieren una coloración grisácea.

Carotenos y Xantofilas

Además de las clorofilas, la espinaca contiene otros pigmentos importantes:

• Carotenos: Son pigmentos fotosintéticos de color amarillo-naranja, esenciales para la fotosíntesis y responsables del color de la espinaca. En el cuerpo humano, los carotenos, especialmente el beta-caroteno (el más abundante en espinacas), se descomponen y se convierten en vitamina A, vital para la salud.
• Xantofilas: Son una familia de compuestos derivados de los carotenos, caracterizados por la presencia de átomos de oxígeno en su estructura, lo que provoca un cambio en su coloración hacia el amarillo. En las hojas de espinaca, las xantofilas se encuentran en menor proporción que los beta-carotenos y las clorofilas (Pérez-Madruga, Y., López-Padrón, I., & Reyes-Guerrero, Y. 2020; Serra Bisbal, J. J. et al. 2020).

Fundamentos Teóricos de la Separación Cromatográfica

Fase Móvil y Fase Estacionaria

La separación cromatográfica se basa en la interacción diferencial de los componentes de la muestra con las dos fases:

• La fase móvil es un fluido (líquido, gas o fluido supercrítico) que actúa como portador de la mezcla. Se desplaza a través de la columna cromatográfica y luego por la fase estacionaria. La naturaleza física de la fase móvil es un factor clave en la clasificación de los métodos cromatográficos.
• La fase estacionaria es el material que se contiene dentro de la columna cromatográfica o se deposita sobre un soporte plano. Este material interactúa con los compuestos de la muestra, reteniéndolos en diferentes grados. Puede ser un sólido con una gran área superficial o un líquido inmovilizado sobre un soporte sólido.

La cromatografía permite la separación de sustancias basándose en la distinta afinidad de los productos por la fase estacionaria (como el gel de sílice) y la fase móvil (el eluyente).

Factor de Retardo (Rf)

El factor de retardo (Rf) es un parámetro que mide la movilidad relativa de cada componente de una mezcla en una cromatografía planar, en relación con la distancia máxima posible recorrida por el frente de la fase móvil. Se calcula como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha del componente y la distancia recorrida simultáneamente por el frente de la fase móvil. Por ejemplo, para un Componente 1, Rf = a / A, y para un Componente 2, Rf = b / A, donde 'a' es la distancia del punto de inicio al punto de muestra, y 'b' es la distancia del punto de inicio al punto de referencia (Mazabel-Riera, E.).

Es fundamental conocer con precisión la fase móvil y la fase estacionaria utilizadas en el experimento para que los datos de Rf sean exactos, ya que esto podría comprometer la fiabilidad del criterio de identificación de la sustancia (Ruiz, V. V. et al. 2020).

Metodología Experimental

Objetivo del Experimento

El objetivo principal de este experimento es extraer los pigmentos fotosintéticos de las hojas de espinaca y separarlos mediante técnicas de cromatografía en columna (CC) y cromatografía en capa fina (CCF).

Preparación de la Muestra de Espinaca

El procedimiento comienza con la preparación de la muestra de espinaca, que incluye los siguientes pasos:

1. Pesar aproximadamente 2 g de hojas de espinaca.
2. Lavar las hojas con agua, retirar los nervios, trocearlas con tijeras y colocarlas en un mortero.
3. Añadir al mortero 22 ml de acetona y 3 ml de hexano, junto con una pequeña cantidad de carbonato cálcico (CaCO₃) para evitar la degradación de los pigmentos fotosintéticos.
4. Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.
5. Transferir solo el líquido obtenido a un embudo de decantación, evitando el paso de sólidos.
6. Añadir 20 ml de hexano y 20 ml de disolución acuosa de NaCl al 10%. Agitar la mezcla y dejar decantar.
7. Desechar la fase acuosa (inferior) y lavar la fase orgánica (superior) con 5 ml de agua desionizada.
8. Decantar nuevamente y transferir la fase orgánica a un Erlenmeyer de 50 ml.
9. Secar la disolución sobre sulfato sódico anhidro y eliminar el desecante por filtración por gravedad.
10. Dividir la muestra: reservar 1 ml de la disolución en un tubo de ensayo para el análisis por cromatografía en capa fina (CCF) y usar el resto para la separación cromatográfica en columna (CC).

Análisis por Cromatografía en Capa Fina (CCF)

Para el análisis por CCF, se siguieron los siguientes pasos:

1. Preparar un rectángulo de papel de filtro de altura y perímetro inferiores a los de la cubeta de cromatografía, colocándolo adosado a la pared interior para permitir una visión clara del cromatofolio.
2. Preparar una disolución eluyente de hexano:acetona en proporción 7:3.
3. Introducir el eluyente en la cubeta (un volumen que permita una altura de disolvente de unos 5 mm) y taparla herméticamente para saturar la atmósfera con vapores del disolvente.
4. Con un lápiz y una regla, trazar una línea horizontal a unos 5 mm de la base de un cromatofolio (Al TLC 5 x 7.5 cm silica gel 60F). La línea debe quedar por encima del nivel del disolvente.
5. Con la ayuda de un capilar de vidrio, aplicar una gota del líquido filtrado sobre la línea trazada en el cromatofolio.
6. Introducir rápidamente el cromatofolio en la cubeta, en posición vertical e ligeramente inclinada, manteniendo visible el nivel del disolvente.
7. Cuando el nivel de disolvente alcance unos pocos milímetros de la parte superior del cromatofolio, extraerlo y dejarlo secar al aire. Se observará la aparición de manchas coloreadas.
8. Marcar con un lápiz el nivel alcanzado por el disolvente.
9. Tapar rápidamente la cubeta para mantener su atmósfera saturada.
10. Observar la aparición de manchas coloreadas a lo largo de la placa, notando que los carotenos avanzan más rápidamente y las clorofilas en menor grado.
11. Determinar el valor del Rf para cada pigmento.

Separación por Cromatografía en Columna (CC)

El procedimiento para la cromatografía en columna incluyó:

1. Colocar un poco de algodón o lana de vidrio en el fondo de la columna.
2. Introducir 10 ml del eluyente (hexano:acetona, 7:3) en la columna.
3. Pesar 20 g de gel de sílice 40 en un Erlenmeyer de 50 ml y añadir unos ml de eluyente, agitando con una varilla de vidrio o espátula, hasta formar una papilla.
4. Llenar la columna con la papilla, abriendo la llave para que el líquido drene hasta el límite justo de la fase estacionaria. Es crucial que la columna nunca se seque y que no se formen burbujas de aire. El disolvente se recoge para su reutilización.
5. Opcionalmente, se puede añadir arena sobre el gel de sílice para formar una capa de 1 o 2 centímetros de espesor sobre el límite de la fase estacionaria.
6. Tomar con una pipeta 10 ml de la muestra de pigmentos de espinaca preparada y añadirla a la columna.
7. Añadir eluyente abriendo la llave de la columna y recogiendo el efluente en un Erlenmeyer.
8. Cuando se acerque una banda de coloración amarilla (beta-caroteno), recoger el líquido en tubos de ensayo.
9. Cambiar de tubo de ensayo cuando este comience a llenarse o cuando el color del contenido cambie, para recoger las diferentes fracciones de pigmentos.

Resultados y Análisis

Los experimentos de cromatografía en capa fina (TLC) mostraron la separación clara de los pigmentos de espinaca, siendo esta técnica la que produjo los mejores resultados en comparación con otros extractos y fases estacionarias probadas.

Pigmentos Identificados y sus Características

La siguiente tabla resume los valores de Rf y las coloraciones observadas para los diferentes pigmentos presentes en la hoja de espinaca, utilizando una disolución de hexano:acetona (7:3) como eluyente:

Estos resultados demuestran que, aunque las hojas de espinaca son de color verde, contienen una variedad de pigmentos con distintas coloraciones y afinidades, lo que permite su separación y visualización individual (Cosi Cutipa, R. V. 2020).

Afinidad de los Pigmentos y la Importancia del Rf

En el análisis realizado, la clorofila mostró una mayor afinidad con la fase estacionaria, lo cual se atribuye a su polaridad. Por otro lado, los carotenos exhibieron una mayor afinidad por la fase móvil, y esta diferencia en polaridad entre el disolvente y los pigmentos justifica los resultados observados (Corpas-Rodríguez, N. et al. 2020). Los carotenos, en particular el beta-caroteno, al ser los pigmentos con mayor afinidad por la fase móvil apolar, son los que avanzan más rápidamente.

El factor de retardo (Rf) es crucial para la identificación de una sustancia, siempre y cuando se conozcan con precisión la fase móvil y la fase estacionaria utilizadas en el experimento. De lo contrario, los datos pueden no ser exactos, lo que comprometería la fiabilidad del criterio de identificación (Ruiz, V. V. et al. 2020).

Observaciones sobre la Fase Estacionaria

Es importante señalar que la tiza no se considera una fase estacionaria adecuada para este tipo de cromatografía. Los experimentos mostraron que, incluso aplicando presión, no hubo separación de los componentes, lo que indica que no facilita la adsorción deseada de los pigmentos (Sinche Leon, J. Y., & Vilcatoma Contreras, T. B. 2019).

Propiedades Fisicoquímicas y Seguridad

Para una comprensión completa del experimento, es fundamental conocer las propiedades de los reactivos y compuestos empleados, así como las precauciones de seguridad necesarias.

Datos de Reactivos

La siguiente tabla recoge los datos de peso molecular (Mw), punto de fusión (P.F.), punto de ebullición (P.E.) y densidad de los reactivos y compuestos utilizados en este experimento de laboratorio:

Consideraciones de Seguridad (GHS)

Los pictogramas de peligro del Sistema Globalmente Armonizado (GHS) indican la peligrosidad de los compuestos químicos. Por ejemplo, el etanol puede causar irritación en los ojos y altas concentraciones de vapor pueden irritar el tracto respiratorio. Los pictogramas para los compuestos utilizados en este experimento se detallan a continuación:

Name	GHS
Acetona
Hexano
CaCO3	No peligroso
Clorofila a	No peligroso
Clorofila b	No peligroso
β-Caroteno	No peligroso
NaCl	No peligroso
Na2SO4	No peligroso

Identificadores Químicos Internacionales (InChI key)

Para facilitar la nomenclatura y formulación, así como la búsqueda de información, se proporcionan los identificadores IUPAC InChI key de los principales compuestos utilizados:

Referencias

• Anwar, M. H. (1963). Separation of plant pigments by thin layer chromatography. Journal of Chemical Education, 40(1), 29.
• Corpas-Rodríguez, N., Gálvez-Cantero, L., Morell-Nápoles, G., López, J. C., Ramos-Sánchez, L. B., & Julián-Ricardo, M. C. (2020). [Fragmento de referencia].
• Cosi Cutipa, R. V. (2020). [Fragmento de referencia].
• Esp, J. A. V. R. M. (2020). [Fragmento de referencia].
• Isac-García, J., Dobado, J. A., Calvo-Flores, F. G., & Martínez-García, H. (2015). Experimental Organic Chemistry Laboratory Manual. Elsevier Science & Technology. ISBN: 978-0-12-803893-2.
• Mazabel-Riera, E. [Fragmento de referencia].
• Pérez-Madruga, Y., López-Padrón, I., & Reyes-Guerrero, Y. (2020). [Fragmento de referencia].
• Rodríguez, V., & Alexander, A. (2020). [Fragmento de referencia].
• Ruiz, V. V., Gamboa, G. T. G., Rodríguez, E. D. V., Cota, F. I. P., Santoyo, G., & de los Santos Villalobos, S. (2020). [Fragmento de referencia].
• Serra Bisbal, J. J., Melero Lloret, J., Martínez Lozano, G., & Fagoaga García, C. C. (2020). [Fragmento de referencia].
• Sinche Leon, J. Y., & Vilcatoma Contreras, T. B. (2019). [Fragmento de referencia].

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