Las levaduras son microorganismos esenciales que, a lo largo de su ciclo vital, obtienen la energía necesaria a partir de los azúcares. Este proceso, bien conocido en la elaboración de bebidas como la cerveza y el vino, se denomina fermentación alcohólica, durante la cual se liberan dióxido de carbono y etanol. Aunque el concepto general es familiar, el mecanismo molecular que transforma una molécula de glucosa en estos compuestos es complejo y fascinante.
La levadura utiliza el ciclo glucolítico de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), más comúnmente conocido como glucólisis, complementado con reacciones adicionales que permiten regenerar el NAD+ mediante la conversión de piruvato en etanol y CO2. Este proceso es un pilar de la bioindustria y objeto de continua investigación para optimizar sus rendimientos.
Fundamentos de la Fermentación Alcohólica
El Rol Biológico de las Levaduras
Las levaduras, predominantemente del género Saccharomyces cerevisiae, son microorganismos unicelulares de la clase de los ascomicetos u hongos marsupiales, generalmente de forma esférica u ovalada, con un tamaño que ronda los 2 a 4 μm. Poseen una estructura con polisacáridos y trazas de quitina. Su citoplasma es viscoso y contiene ribosonucleoproteínas, lípidos y carbohidratos, permitiendo importantes procesos enzimáticos. El núcleo celular es un cuerpo en forma de bola u óvalo que contiene ADN y ARN, mientras que la vacuola se forma en el plasma durante el envejecimiento celular.
Una característica clave de la levadura es ser un microorganismo anaerobio facultativo, lo que significa que puede vivir tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. En su estado natural, se encuentra sobre pieles de frutas, cereales o flores, y prefiere la respiración aeróbica para obtener mayor energía. Sin embargo, cuando se halla en un medio con altas concentraciones de glucosa y bajos niveles de oxígeno, recurre a la fermentación, un proceso menos eficiente energéticamente, pero suficiente para un organismo sencillo.
Los microorganismos Saccharomyces cerevisiae se reproducen por gemación. El nutriente de reserva principal de la levadura es el glucógeno, estructuralmente similar a la amilopectina. Cuando el azúcar escasea, el glucógeno se agota rápidamente, influyendo en el estado fisiológico y la capacidad de fermentación de la levadura.
Metabolismo de los Azúcares por Levaduras
Antes de que la levadura pueda metabolizar los azúcares complejos, debe convertirlos en monosacáridos. Algunos azúcares con los que se encuentra la levadura son disacáridos (dos moléculas de azúcar) y, en el caso de la maltotriosa, un trisacárido (tres moléculas). Ante estas situaciones, la levadura rompe previamente los enlaces químicos para separar las moléculas y metabolizar así la glucosa.
- En el exterior de la célula, la sacarosa (un disacárido) se hidroliza a glucosa y fructosa por una enzima invertasa de la membrana, y estos dos azúcares entran en la célula por difusión facilitada.
- La maltosa (disacárido de dos glucosas) y la maltotriosa (trisacárido de tres glucosas) pueden penetrar enteras en la célula por las enzimas permeasas de la membrana y, una vez dentro, son degradadas en moléculas de glucosa.
Para iniciar el proceso de fermentación del azúcar y su paulatina transformación en alcohol, la célula de levadura consume principalmente glucosa y fructosa. El ácido acético es absorbido por las células junto con la glucosa.
La Ruta Bioquímica: De la Glucosa al Etanol y Dióxido de Carbono
La fermentación alcohólica es un proceso biológico que ocurre en ausencia de oxígeno, originado por la actividad de microorganismos como las levaduras, que procesan carbohidratos (principalmente azúcares como glucosa, fructosa, sacarosa) para obtener etanol, dióxido de carbono y moléculas de adenosín trifosfato (ATP) para su metabolismo energético anaerobio.
Este procedimiento bioquímico de transformación de azúcares, incluidos polisacáridos y monosacáridos (triosas, tetrosas, pentosas y hexosas), en alcohol, se divide en dos etapas principales.
Glucólisis
La glucólisis tiene como objetivo la liberación de energía de la glucosa para obtener adenosín trifosfato (ATP), una fuente de energía universal para las células. Una vez que la glucosa se encuentra dentro de la levadura, se produce una serie de reacciones que, aunque inicialmente requieren una inversión de energía, resultan en una ganancia neta de ATP.
La glucólisis se desarrolla en varias etapas:
- Un grupo fosfato de un ATP se transfiere a la glucosa, dando como resultado glucosa fosfato y adenosín difosfato (ADP).
- La glucosa fosfato se isomeriza, transformándose en fructosa fosfato.
- La fructosa fosfato reacciona con un segundo ATP, produciendo fructosa bisfosfato y otro ADP. Esta etapa es crucial para evitar que la fructosa fosfato, que es inestable, revierta a glucosa fosfato.
- La fructosa bisfosfato, de seis carbonos, se divide en dos moléculas de tres carbonos cada una: dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehído-3-fosfato (GAP).
- La DHAP es isomerizada a una segunda molécula de GAP.
Hasta aquí se completa la primera etapa de la glucólisis. De una molécula de glucosa se obtienen dos moléculas de GAP y se consumen dos ATP. A partir de este punto, cada reacción subsiguiente ocurrirá dos veces, ya que se parte de dos moléculas de GAP.
- Un NAD+ (coenzima esencial para el intercambio de electrones y protones) se une a la molécula de GAP y coge dos electrones y un hidrógeno. A cambio, el GAP toma un fosfato libre para formar bisfosfoglicerato (BPG). El NAD+, al reducirse, se transforma en NADH, un portador de energía.
- Una molécula de ADP se encuentra con el BPG, y este le transfiere un fosfato para formar ATP, convirtiendo el BPG en 3-fosfoglicerato (3PG).
- Una enzima isomeriza la molécula de 3PG, cambiando la posición del grupo fosfato y formando 2-fosfoglicerato (2PG).
- El 2PG pierde una molécula de agua (H2O), dando lugar a fosfoenolpiruvato (PEP).
- El PEP cede un grupo fosfato a una molécula de ADP, produciendo ATP y transformándose en piruvato.
Aquí termina la ruta metabólica de la glucólisis. La reacción global es:
Glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + Pi → 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 4 H+
En el caso de la respiración aeróbica, el metabolismo continuaría con el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa, generando una gran cantidad de ATP. Sin embargo, en condiciones anaeróbicas, la glucólisis por sí sola genera una ganancia neta de 2 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa, lo cual es suficiente para organismos sencillos como la levadura.
Formación de Etanol y Dióxido de Carbono a partir del Piruvato
El principal desafío en ausencia de oxígeno es que no se puede realizar la fosforilación oxidativa, lo que impide la regeneración de NAD+. Dado que el NAD+ es esencial para la glucólisis (reacción 6), su agotamiento detendría la producción de ATP. Para superar esto, la levadura recurre a una estrategia de regeneración del NAD+ a través de la conversión del piruvato:
- Al piruvato producido en la glucólisis se le extrae una molécula de dióxido de carbono (CO2), formando acetaldehído. Esta reacción es catalizada por la enzima piruvato descarboxilasa, clave en la fermentación alcohólica y no presente en otros seres vivos.
- Posteriormente, el NADH (el portador de energía reducido de la glucólisis) convierte el acetaldehído en etanol, un alcohol. Esta reacción es catalizada por la enzima alcohol deshidrogenasa y, lo más importante, regenera NAD+. Este NAD+ puede reciclarse en la glucólisis para seguir sintetizando ATP.
Esquemáticamente, las reacciones son:
Piruvato → Acetaldehído + CO2 (Piruvato descarboxilasa)
Acetaldehído + NADH → Etanol + NAD+ (Alcohol deshidrogenasa)
De esta manera, la levadura asegura su suministro continuo de energía en condiciones anaeróbicas. En términos energéticos, en condiciones de anaerobiosis, las levaduras desvían su metabolismo para la fermentación alcohólica, siendo el etanol y el dióxido de carbono los únicos dos productos de desecho de todo el procedimiento.
Factores que Influyen en la Fermentación Alcohólica
La eficiencia de la fermentación alcohólica es compleja debido a la interrelación de múltiples factores que deben ser controlados, especialmente en el ámbito industrial.
Concentración de Azúcares
La concentración de hidratos de carbono, tanto monosacáridos como disacáridos, es un factor crítico. Una concentración excesiva puede frenar la actividad de la levadura al afectar los procesos osmóticos de las membranas celulares, mientras que una concentración demasiado baja puede ralentizar el proceso. Los azúcares más utilizados en la fermentación son dextrosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
Acidez (pH)
El pH del sustrato afecta significativamente a las levaduras, que se ven claramente afectadas por ambientes tanto alcalinos como ácidos. Su funcionamiento óptimo se encuentra en un rango de pH de aproximadamente 3.5 a 5.5. Los procesos industriales buscan mantener estos niveles óptimos de acidez, usualmente mediante el empleo de disoluciones tampón. Un pH bajo del medio (pH < 4.0), particularmente asociado a altas temperaturas, ha demostrado ser un factor de gran interés fisiológico para las levaduras utilizadas en la producción industrial de etanol.
Temperatura
La fermentación es un proceso exotérmico. Las levaduras son seres mesófilos y tienen un régimen de funcionamiento con rangos de temperatura óptimos, generalmente entre 29 y 30 grados Celsius. Temperaturas por debajo o por encima de este rango pueden afectar su actividad vital y su tasa de reproducción. Si cualquier levadura se expone a una temperatura cercana o superior a 55 °C por un tiempo de 5 minutos, se produce su muerte. Un régimen de temperatura dentro de 28-29 grados Celsius es crucial para no exceder la tasa de reproducción de los Saccharomycetes.
Nutrientes
La levadura es un microorganismo heterótrofo y saprófito, lo que significa que se alimenta por absorción y requiere fuentes elaboradas de nutrientes para su desarrollo y metabolismo:
- Carbono: Principalmente glucosa, manosa, fructosa o galactosa. Las células de levadura consumen estas fuentes de carbono para obtener energía química y el esqueleto carbónico de sus estructuras celulares.
- Nitrógeno: Es fundamental para la síntesis de proteínas. La forma amoniacal es la principal, pero en su ausencia, la levadura puede usar aminoácidos, lo que puede aumentar la producción de componentes secundarios (alcoholes isoamílico, amílico, propílico, isopropílico, butílico, isobutílico).
- Fósforo: Se absorbe en forma de ion H2PO4- (predominante a pH 4.5) y es un elemento para asegurar la resistencia de la levadura.
- Azufre: Se asimila del sulfato, sulfito o tiosulfato, y está presente en aminoácidos y vitaminas. Su uso excesivo puede ser letal.
- Magnesio: Responsable de la activación de enzimas clave como la fosfatasa y la enolasa, y ayuda a conservar la actividad de ciertas enzimas durante un aumento de la temperatura.
- Calcio: Utilizado por la levadura para activar procesos en el microorganismo, acumular glucógeno y aumentar el porcentaje de esteroles, lo que incrementa la capacidad de multiplicación.
- Vitaminas: Actúan como cofactores en enzimas. Todas las vitaminas son importantes, con la excepción de la biotina, que puede no ser siempre esencial.
- Ácidos Grasos: Afectan el crecimiento de la levadura, como el ácido oleico.
La levadura alcohólica se alimenta de forma exógena (nutrientes del medio ambiente) y endógena (nutrientes acumulados internamente), activando el segundo método en condiciones de escasez.
Historia y Aplicaciones Industriales de la Fermentación Alcohólica
La fermentación alcohólica es un procedimiento físico, químico y biológico empleado con frecuencia en la industria de alimentos, en particular en la elaboración de bebidas alcohólicas como el vino y la cerveza, y más recientemente en la producción de biocombustibles.
Un Viaje Histórico
La humanidad ha empleado la fermentación alcohólica desde tiempos inmemoriales, incluso antes de comprender el proceso o sus responsables. Los griegos atribuían el descubrimiento al dios Dionisio. Científicos como MacBride (1764) identificaron el CO2 resultante, Cavendish (1766) lo describió y determinó su proporción, y Antoine Lavoisier (1789) analizó los elementos intervinientes.
En 1815, Joseph Louis Gay-Lussac fue el primero en determinar una reacción de fermentación obteniendo etanol a partir de glucosa, estableciendo lo que hoy se conoce como el rendimiento Gay-Lussac (G-L), con un valor máximo teórico del 51.1% (masa/masa) para la glucosa. Sin embargo, los fundamentos exactos seguían siendo un misterio.
El siglo XIX fue testigo de un intenso debate científico. Erxleben, De La Tour, Schwann y Kützing descubrieron en la década de 1830 que las levaduras eran la causa del proceso. Pero fue Louis Pasteur, en 1863, quien introdujo el concepto de la acción de microorganismos. Finalmente, en 1897, Eduard Buchner descubrió que la enzima zimasa era la responsable de la fermentación alcohólica, un hallazgo que le valió el Premio Nobel de Química. Posteriormente, Harden y Young (1904) mostraron la dependencia de la fermentación de una sustancia de bajo peso molecular, la cozimasa (una mezcla de iones fosfatados, difosfato de tiamida y NAD+), cuya caracterización se completó en 1935. Otto Heinrich Warburg y Hans von Euler-Chelpin (1929) descubrieron el papel del cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NADH).
Procesos Industriales
La fabricación de etanol mediante fermentación y destilación se divide en cuatro fases básicas: preparación del material de partida (sacarificación), licuefacción, fermentación y destilación. Para la producción de vino y cerveza, la fase de destilación no es necesaria.
La fase de fermentación implica añadir microorganismos (hongos o bacterias) que transforman los azúcares en alcohol. Esta etapa es la que más directamente afecta el resultado de la producción de alcohol y, por lo tanto, es una de las más estudiadas.
La industria busca constantemente mayores rendimientos. En 1937, Firmin Boinot patentó en Francia un procedimiento para fermentaciones alcohólicas industriales, que llegó a Brasil en los años treinta y es conocido como el procedimiento Melle-Boinot. Este método promueve la reducción drástica de la población bacteriana mediante la reutilización de microorganismos, su separación centrífuga y un tratamiento ácido. Después de este tratamiento, la "leche de levadura" concentrada se regresa al proceso.
Durante la fermentación, además del etanol y CO2, se generan otros subproductos como glicerol, ácidos orgánicos (succínicos, acéticos, pirúvicos), alcoholes superiores, acetaldehído, acetoína y butilenglicol. Las iniciativas para reducir el consumo de azúcares en procesos parasitarios y subproductos no deseados son constantes.
Los métodos de fermentación continua, patentados desde la década de los 50, han permitido un crecimiento apreciable de la industria de bebidas alcohólicas, ofreciendo un ritmo apropiado de producción en ambientes controlados.
Innovación en la Fermentación: La Liberación y la Inoculación de Hidrógeno
Aunque la fermentación alcohólica es un proceso conocido y optimizado, la búsqueda de mayores eficiencias y rendimientos sigue siendo una constante en la investigación y desarrollo industrial. Los procedimientos reales pueden alcanzar valores máximos de rendimiento fermentativo que oscilan entre el 92% y el 94% del rendimiento teórico máximo de Gay-Lussac (0.511 m/m para glucosa y 0.538 m/m para sacarosa), en los ambientes productivos más asépticos y controlados.
Tradicionalmente, la técnica anterior no ha descrito específicamente la acción directa del hidrógeno en un procedimiento metabólico de fermentación para la producción selectiva de alcohol. Sin embargo, una innovación tecnológica ha surgido para abordar esta área.
La presente invención consiste en un procedimiento bioquímico innovador para la producción selectiva de alcohol a través de la fermentación de azúcares (polisacáridos y monosacáridos como sacarosa, glucosa, fructosa y xilosa), con una mayor utilización de carbono y un consiguiente aumento en la producción selectiva de alcohol, logrando superar el rendimiento teórico de Gay-Lussac y reduciendo la emisión de dióxido de carbono en la fermentación.
Este procedimiento innovador no altera genéticamente los microorganismos, sino que modifica el límite de eficiencia másica de producción de alcohol para parámetros mayores, alterando el metabolismo celular de los microorganismos.
Mecanismo de Acción del Hidrógeno
La clave de esta innovación reside en la inoculación de hidrógeno en estado atómico, iónico o gaseoso, o mezclas de los mismos, directamente en los microorganismos presentes en el medio fermentativo. Esto se logra por medio de al menos dos electrodos aplicados directamente al mosto bajo fermentación, con la aplicación de voltaje en un régimen de pre-electrólisis o electrólisis completa. El hidrógeno generado por voltaje eléctrico en los electrodos contribuye a este proceso.
La presencia de hidrógeno, preferiblemente en alta disponibilidad o abundancia, resulta en la formación de equivalentes reductores (RE/ER). Esto se deriva de la unión del grupo carbonilo con el grupo hidroxilo, derivados por descarboxilación de las moléculas de piruvato, lo que finalmente lleva a la formación de productos de mayor eficiencia.
El uso de este método innovador busca mejorar la eficiencia de la fermentación alcohólica, ofreciendo una vía para superar los límites teóricos conocidos y lograr una producción de alcohol más eficiente y ambientalmente sostenible al reducir las emisiones de CO2.
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