La fermentación es un proceso biotecnológico fundamental en la producción de diversas bebidas, y el estudio de los microorganismos involucrados es crucial para optimizar la calidad sensorial del producto final. Este artículo profundiza en la actividad fermentativa de la levadura **Saccharomycodes ludwigii**, especialmente en el contexto del jugo de manzana, y explora cómo diversos factores influyen en su metabolismo y en la producción de compuestos aromáticos.
Introducción a Saccharomycodes ludwigii
La levadura **Saccharomycodes ludwigii** es un microorganismo no-Saccharomyces que a menudo se considera contaminante en la producción de alimentos y bebidas fermentadas, como es el caso de los vinos. Estas levaduras habitan en lugares donde hay fuentes de azúcares fermentables y sustancias nutritivas que les permitan crecer, por ejemplo, en jugos de fruta, frutas dañadas, néctar de flores y en la superficie de los equipos utilizados en la producción de vino. Durante la fermentación natural, las levaduras no-Saccharomyces convierten los azúcares en etanol, dióxido de carbono y en un sinnúmero de compuestos volátiles y no volátiles que contribuyen a la composición química y sensorial de las bebidas fermentadas.
Estas levaduras forman parte de la microflora que predomina durante los primeros 2-3 días de la fermentación alcohólica espontánea. Sin embargo, debido a su sensibilidad al etanol (5-6% v/v), su crecimiento declina rápidamente y mueren. Subsecuentemente, levaduras como **Saccharomyces cerevisiae**, que son más resistentes al etanol, toman el control de la fermentación y completan el proceso. La fermentación continúa hasta el agotamiento de los azúcares o hasta que algún componente esencial para el crecimiento se agote, o bien, hasta que aparezca el efecto inhibidor de los metabolitos producidos durante la fermentación. En general, se considera que las levaduras no-Saccharomyces cumplen un rol importante en la definición del perfil sensorial de vinos y también de otras bebidas fermentadas.
Metabolismo de Azúcares en Saccharomycodes ludwigii
Degradación y Vías Metabólicas
Los azúcares fermentables son la fuente de energía más importante en el metabolismo de levaduras. **Saccharomycodes ludwigii**, al igual que las demás levaduras, utiliza vías metabólicas comunes para la degradación de azúcares. Para ser utilizados, los azúcares deben ser transportados hacia el interior de la célula mediante mecanismos de transporte específicos. La velocidad de utilización de azúcares está influenciada por la concentración y el tipo de azúcar, la concentración de oxígeno disuelto en el medio, la temperatura de fermentación y el pH, entre otros factores. Una vez dentro de la célula, el azúcar es fosforilado y así entra a la vía de la glucólisis, la cual termina en la formación de piruvato, proceso llevado a cabo en el citosol.
Luego, el piruvato formado puede ser incorporado, bien al metabolismo respiratorio o al fermentativo, dependiendo de la concentración de azúcar (glucosa) y oxígeno disuelto en el medio. Existen pocas investigaciones desarrolladas sobre la actividad fermentativa de **Saccharomycodes ludwigii**; sin embargo, se le considera una levadura **"Crabtree negativo"** en correlación a su carácter "petite negativo". Por otro lado, se ha reportado que manifiesta una deficiencia respiratoria dependiendo de la concentración de oxígeno en el medio.
Metabolismo Respiratorio y Respirofermentativo
Las levaduras **"Crabtree negativas"** presentan un metabolismo respiratorio aún cuando la concentración de azúcar (glucosa) en el medio es relativamente alta. Esta característica ha servido para denominarlas levaduras oxidativas. En estas levaduras, cultivadas en medios con altas concentraciones de azúcar y en condiciones aerobias, el piruvato se metaboliza preferentemente vía piruvato deshidrogenasa hasta acetil-CoA y luego éste entra al ciclo de Krebs para su oxidación completa. Esto se debe a que presentan bajos niveles de piruvato descarboxilasa y una alta actividad de enzimas respiratorias como la piruvato deshidrogenasa, acetaldehído deshidrogenasa y acetil-CoA sintetasa.
La ausencia de oxígeno en el medio es crucial y conduce a la cesación del crecimiento de las levaduras **"Crabtree negativas"**. Sin embargo, se ha reportado que en condiciones anaerobias, **Saccharomycodes ludwigii** es capaz de crecer, un comportamiento similar al observado en **Saccharomyces cerevisiae**. Esta característica explicaría el porqué esta levadura es habitualmente encontrada al final de la fermentación.
Algunas investigaciones han reportado además la producción de acetato, glicerol y etanol por estas levaduras. Esto se debería a una baja actividad de las enzimas respiratorias, especialmente la piruvato deshidrogenasa, acetaldehído deshidrogenasa y la acetil-CoA sintetasa, como resultado de la limitación de oxígeno en el medio, lo que a la vez conduce a una disminución de la tasa de respiración y a la estimulación del metabolismo respirofermentativo. Asimismo, la producción de glicerol en medios con alta concentración de azúcar estaría conectada a un mecanismo de adaptación que utiliza la levadura frente al estrés osmótico para prevenir su deshidratación.
La formación de glicerol está acoplada a la oxidación de NADH a NAD+, lo que causa un desbalance redox en el citosol (NADH:NAD+), el cual es corregido con la producción de ácido acético, cuya síntesis reconvierte nuevamente NAD+ a NADH. A condiciones de limitación de oxígeno, se estimularía el metabolismo respirofermentativo; así entonces, el piruvato es convertido en acetaldehído por la piruvato descarboxilasa y luego puede ser reducido bien a etanol por la alcohol deshidrogenasa, u oxidado a ácido acético por la acetaldehído deshidrogenasa NADP-dependiente. El acetaldehído funciona como receptor terminal de electrones cuya reducción por el NADH genera etanol. En levaduras **"Crabtree negativas"** en presencia de oxígeno, el acetaldehído es preferentemente oxidado a acetato por la acetaldehído deshidrogenasa y luego convertido en acetil-CoA por la acetil-CoA sintetasa. Sin embargo, la acumulación de ácido acético bajo condiciones de limitación de oxígeno resultaría de la insuficiente actividad de la acetil-CoA sintetasa requerida para la oxidación completa del acetato. Por otro lado, la producción de glicerol estaría también ligada a la necesidad de reoxidar el NADH generado durante la glucólisis.
Efecto del Etanol y Sulfito en Saccharomycodes ludwigii
El etanol inhibe la viabilidad de las células, la tasa de crecimiento específico y la tasa específica de fermentación. Se considera que el etanol provoca la disminución del contenido de esteroles en la membrana celular y esto afecta el transporte de azúcares. Asimismo, se considera que el etanol tendría un efecto inhibidor sobre la actividad del sistema hexoquinasa, enzimas responsables de transferir grupos fosfato de una molécula a otra en la glucólisis. En general, la tolerancia al etanol depende de la habilidad de la célula de levadura para exportar el etanol producido hacia el exterior, un proceso que depende de la composición y fluidez de la membrana citoplasmática. Estudios han reportado la capacidad de **Saccharomycodes ludwigii** de tolerar altas concentraciones de etanol, llegando a observarse la producción de etanol en concentraciones de hasta 12-14% v/v.
El dióxido de azufre se ha utilizado desde hace mucho tiempo como agente antimicrobiano durante la elaboración de vinos y otras bebidas fermentadas. Este compuesto inhibe el crecimiento de bacterias y ciertas levaduras, entre ellas las no-Saccharomyces. La capacidad inhibitoria del SO2 está influenciada por el pH del medio. El pH determina el equilibrio entre tres compuestos: el SO2, HSO3- y SO3=2. El SO2 es el responsable del efecto tóxico y su concentración en medio acuoso es favorecida por valores bajos de pH, ya que provoca el desbalance del equilibrio hacia este compuesto.
Los sulfitos tienen actividad a nivel del metabolismo energético, afectando la glucólisis. Bajas concentraciones conducen a una rápida reducción del contenido de ATP en las células de levadura a pH bajos. Las enzimas más afectadas serían la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa. Asimismo, el sulfito sería responsable de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa, enzima responsable de la reducción del acetaldehído a etanol durante la fermentación.
Producción de Compuestos de Importancia Sensorial por Saccharomycodes ludwigii
Las condiciones de cultivo que conducen al metabolismo respirofermentativo en levaduras resultan en la producción de compuestos de importancia sensorial, los cuales, dependiendo de sus concentraciones, pueden influir positiva o negativamente en la calidad organoléptica de las bebidas fermentadas. Estos compuestos incluyen el etanol, glicerol, ácido acético y un sinnúmero de compuestos volátiles. Por ejemplo, de los 1000 compuestos volátiles encontrados en vinos, aproximadamente 400 son producidos por la actividad de levaduras. Entre los compuestos volátiles producidos están los ésteres, alcoholes superiores, cetonas, aldehídos y ácidos orgánicos, entre otros.
Paso a paso para la fermentación y obtención de un cacao fino y de aroma.
La síntesis de ésteres es de mayor interés, ya que su presencia determina el sabor, olor y aroma frutal de las bebidas fermentadas. Los ésteres representan el mayor grupo de componentes aromáticos en bebidas alcohólicas fermentadas; son producidos mediante reacción enzimática dentro de la célula de levadura, siendo la enzima que cataliza la reacción la acetiltransferasa y/o la éster sintasa. Los alcoholes superiores, por otra parte, son formados a partir de α-cetoácidos, los cuales pueden derivar de los correspondientes aminoácidos (valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, etc.), por desaminación a través de la vía de Ehrlich o a partir del metabolismo de la glucosa como precursores en la síntesis de aminoácidos. Estudios realizados con **Saccharomycodes ludwigii** reportaron una elevada producción de isobutanol, isoamil alcohol, etil acetato y ácido acético.
Concentraciones de alcoholes superiores sobre 400 mg/L contribuyen negativamente a la calidad organoléptica, especialmente en vinos. A excepción de 2-feniletanol, el cual presenta aroma floral y cuyo valor umbral de percepción es 10 mg/L, los demás alcoholes superiores imparten características sensoriales desagradables.
Estudio de la Actividad Fermentativa de Saccharomycodes ludwigii RIVE 16-1-5
Objetivos y Metodología
El presente estudio se realizó con la finalidad de contribuir al entendimiento de la actividad fermentativa de **Saccharomycodes ludwigii** RIVE 16-1-5 y su relación con la concentración de oxígeno en el medio. Además, se discute la producción de compuestos químicos de importancia sensorial como un potencial que puede ser ventajoso y aprovechable para la producción de bebidas fermentadas con características sensoriales particulares, en este caso, a partir de jugo de manzana. Todos los experimentos se realizaron utilizando la cepa de levadura **Saccharomycodes ludwigii** RIVE 16-1-5, adquirida de la colección de levaduras del Instituto de Investigación de Viticultura y Enología, Bratislava-República Eslovaca, y fue mantenido en agar extracto de malta a 7ºC, con renovación periódica cada 3 meses.
Resultados Destacados
Se ha estudiado la actividad fermentativa de **Saccharomycodes ludwigii** RIVE 16-1-5 con la finalidad de evaluar su importancia en los procesos fermentativos. Los resultados mostraron que esta cepa fermenta bien monosacáridos y además sucrosa y maltosa. Su actividad fermentativa no es inhibida a concentraciones de hasta 200 mg/L de metabisulfito de sodio en el medio. Además, produce etanol hasta 6.88±0,1% v/v.
La agitación del medio de cultivo incrementa la producción de alcoholes superiores (843.7 mg/L) y, por el contrario, disminuye la producción de glicerol (0.18±0.2 g/L) y ácido acético (56.0±8.5 mg/L). La producción de etil acetato en cultivo agitado (130.0±8.0 mg/L) fue mayor que en cultivo estático (sin agitación).
Durante el cultivo batch en biorreactor a condiciones aireadas, la tasa de crecimiento (p) alcanzó el valor de 0.11 h-1. La concentración de oxígeno en el medio afectaría su metabolismo; así, cantidades insuficientes de oxígeno provocan un metabolismo respirofermentativo con la producción de etanol, alcoholes superiores, ésteres y ácido acético. El control de la aireación durante la fermentación es una herramienta importante para controlar el balance entre la actividad respiratoria y fermentativa. Finalmente, los mejores resultados en calidad sensorial en lo referente al aroma, sabor y olor se obtuvieron en cultivo estático.
Otros Estudios sobre Fermentación de Sidra de Manzana
Un estudio complementario examinó el efecto de fermentaciones simultáneas de **diferentes levaduras y bacterias** en la composición química de la sidra de manzana de dos variedades - Topaz y Red Topaz. Para ello, se emplearon técnicas analíticas avanzadas (**HPLC-RID, HPLC-VWD, GC/MS, GC/FID, HPLC-DAD ESI+**) para analizar glúcidos, ácidos orgánicos, compuestos volátiles, aminoácidos y compuestos fenólicos. Se realizaron análisis estadísticos y **análisis de componentes principales (PCA)** para evaluar las correlaciones entre las muestras basadas en los compuestos identificados.
En las fermentaciones mixtas, como las realizadas con **levaduras y bacterias lácticas**, la cantidad de ácido láctico fue mayor en comparación con otras muestras, demostrando la efectividad de la fermentación maloláctica simultánea a la fermentación alcohólica. La fermentación con **ciertos cultivos mixtos** resultó en la formación de mayores cantidades de compuestos volátiles. Además, el análisis sensorial reveló que **una combinación específica de levaduras y bacterias** distinguía notas a manzana, frutales y florales. Este estudio sugiere que la inoculación simultánea de **levaduras y no-levaduras (bacterias)** resulta en una sidra con sabores más complejos.