Introducción al Campo de la Fermentación y la Teoría Microbiana
En el campo de la fermentación, Louis Pasteur demostró que ésta era el resultado de la acción de organismos vivos microscópicos que no se reproducían cuando se aniquilaban o excluían. Pasteur sometió estos organismos a la acción del calor, lo que marcó el inicio de un proceso más complejo denominado en su honor, pasteurización.
El doctor Luis Pasteur puso fin al debate sobre el origen de la vida y la fermentación con un artículo publicado en 1861. En él, presentó resultados que demostraban la existencia de microorganismos en el aire que nos rodean y que podían contaminar hasta el cultivo más esterilizado. En una conferencia presentada en la Sorbona en 1864, Pasteur aseveró: “No hay ninguna circunstancia hasta hoy conocida en la que se pueda afirmar que seres microscópicos han venido al mundo sin gérmenes, sin padres semejantes a ellos”.
En sus investigaciones, Pasteur contó con la colaboración de un médico alemán, Robert Koch. Juntos, se convirtieron en los fundadores de la bacteriología y de la teoría del origen microbiano de los procesos infecto-contagiosos. Gracias a sus investigaciones, se llegó a conocer con gran precisión la relación causal entre microorganismos y enfermedades.
La Vacunación como Producto de la Teoría Microbiana
Producto de la teoría microbiana de la enfermedad fue el desarrollo de la vacunación. Hacia 1880, Pasteur aisló el microbio responsable del cólera de las gallinas y logró disminuir su virulencia. Lo hizo inyectando a las gallinas microbios debilitados, una técnica introducida previamente por Edward Jenner, con lo que consiguió detener la epidemia.
La penicilina, descubierta en 1928 por Alexander Fleming, también se originó a partir de la teoría microbiana de las enfermedades. Fleming observó que unos cultivos bacterianos olvidados en su laboratorio habían sido invadidos por un hongo verdoso, y que alrededor de este hongo no crecía ninguna bacteria, lo que evidenciaba su propiedad antibacteriana.
Bacterinas Tratadas con Calor y Vacunas de Emulsión
La presente invención se refiere al campo de las vacunas y a métodos para estabilizar vacunas de emulsión. En particular, se centra en bacterinas tratadas con calor, un método para su producción y las vacunas de emulsión preparadas a partir de ellas.
Antecedentes de la Invención
La vacunación se utiliza cada vez más para controlar las enfermedades infecciosas en animales. A menudo se emplean adyuvantes en las vacunas, ya que pueden potenciar la respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas se formulan frecuentemente como emulsiones porque estas pueden actuar como adyuvantes y retener el antígeno en el sitio de inyección, creando un depósito.
En las vacunas de emulsión, comúnmente se usan emulsionantes. La estabilidad de estas vacunas también se puede lograr reduciendo el tamaño de las gotas de la emulsión por medios mecánicos. La Patente de Estados Unidos N° 5.084.269 describe una formulación adyuvante que contiene lecitina y aceite mineral, la cual reduce la irritación en el animal hospedador y, simultáneamente, induce una mayor inmunidad sistémica.
Generalmente, los antígenos bacterianos son inestables al calentarse; incluso una breve exposición a altas temperaturas puede disminuir su actividad. Por ejemplo, las vacunas contra el ántrax pueden perder toda su actividad biológica tras 48 horas a 37°C.
Sumario de la Invención
La invención se refiere a bacterinas tratadas con calor, a un método para su producción y a vacunas de emulsión preparadas a partir de estas. El método comprende calentar la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a 80°C para formar una bacterina tratada con calor.
Definiciones Clave
- Actividad antigénica aceptable: Capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en animales vacunados tras la exposición o al superar un ensayo de potencia codificado con organismos vivos homólogos.
- Bacterina: Suspensión de bacterias muertas que se utiliza como componente de una vacuna.
- Emulsionante: Sustancia utilizada para obtener una emulsión más estable.
- Bacterina tratada con calor: Bacterina que ha sido tratada térmicamente y presenta una actividad lipasa del 50% o inferior en comparación con su actividad previa al tratamiento, manteniendo una actividad antigénica aceptable.
- Emulsión invertida: Emulsión de agua en aceite.
- Lipasa: Grupo de enzimas (esterasas, lipasas y fosfolipasas) que pueden degradar emulsionantes en una vacuna de emulsión.
- Emulsión normal: Emulsión de aceite en agua.
- Emulsión de aceite en agua: Emulsión donde gotas de aceite se suspenden en una fase acuosa continua.
- Temperatura ambiente: Temperatura entre 18 y 25°C.
- Emulsión de agua en aceite: Emulsión donde gotas de agua se suspenden en una fase oleosa continua.
Reducción de la Actividad Lipasa en Bacterinas
Esta invención aborda la reducción de la actividad lipasa en bacterinas para mejorar la estabilidad de las vacunas. Algunas bacterinas poseen actividad lipasa, la cual, al incorporarse en una emulsión, puede degradar los emulsionantes, resultando en emulsiones inestables.
La lipasa, que puede degradar los emulsionantes y causar inestabilidad y ruptura de la emulsión, incluye enzimas como esterasas, lipasas y fosfolipasas. La actividad lipasa de una bacterina se mide utilizando un sustrato sintético, como la O-pivaloiloximetil umbeliferona (C-POM), observando la velocidad de hidrólisis. Métodos bibliográficos para esta medición se describen en varios artículos científicos.
La ruptura de la emulsión en una vacuna puede llevar a la separación de fases, lo que significa que las dosis individuales extraídas de un recipiente pueden no contener la misma concentración de componentes. Además, la pérdida de emulsión puede disminuir la actividad adyuvante y reducir el efecto antigénico de la vacuna.
Cuando se introducen virus vivos atenuados en las vacunas junto con bacterinas, la actividad lipasa presente en la bacterina puede liberar el emulsionante, el cual puede romper e inactivar los virus vivos, ocasionando una pérdida de infectividad viral. Una bacterina útil se forma cultivando la bacteria y luego destruyéndola por diversos métodos, como la exposición a compuestos químicos (mertiolato, formalina, etc.) o radiación esterilizante.
Se ha descubierto que la actividad lipasa de una bacterina puede reducirse mediante tratamiento con calor. Calentar la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a 80°C durante un período suficiente reduce la actividad lipasa a un 50% o menos en comparación con la actividad previa al tratamiento, formando una bacterina tratada con calor que conserva una actividad antigénica aceptable.
No es necesario reducir la actividad lipasa a cero para lograr una buena estabilidad en una vacuna de emulsión. Las bacterinas tratadas con calor con un nivel de actividad lipasa reducido (50% o menor) son estables. La medición comparativa de la velocidad de hidrólisis del sustrato de ensayo antes y después del tratamiento con calor permite evaluar la reducción de la actividad lipasa.
Ensayos de Actividad Antigénica
Para bacterinas que comprenden especies de Leptospira (como L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa o L. pomona), existen ensayos codificados para la actividad antigénica. En estos casos, una actividad antigénica aceptable se define como la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en hámsters vacunados, resultando en una supervivencia de al menos el 75% de los animales tras la exposición a bacterias vivas homólogas, en un modelo donde el 80% de los no vacunados no sobreviven.
Para el antígeno Leptospira hardjo, una actividad antigénica aceptable se define como la capacidad de una vacuna para inducir una titulación media geométrica de aglutinación serológica de ≥40 en terneros vacunados. Para otras bacterinas, se refiere a la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora tras la exposición a un organismo vivo homólogo.
Método de Tratamiento Térmico
El tratamiento térmico puede realizarse en un rango de temperaturas de aproximadamente 35 a 80°C durante un período de aproximadamente 20 minutos a 24 horas. Temperaturas más altas (75-80°C) requieren tiempos de calentamiento más cortos, mientras que temperaturas más bajas requieren períodos más largos. Combinaciones específicas de temperatura y tiempo incluyen calentamiento a 60-70°C durante 9-10 horas, o a 65-70°C durante 5-8 horas, o incluso durante una hora.
Las bacterinas tratadas con calor, con su actividad lipasa reducida, pueden ser formuladas en vacunas de emulsión utilizando métodos de producción convencionales, bien conocidos en la técnica.
Investigaciones Futuras en Vacunas y Biotecnología Vegetal
Investigadores de la Universidad de California en Riverside (UC Riverside) están explorando la posibilidad de convertir plantas comestibles, como la lechuga, en fábricas de vacunas de ARNm. Esta tecnología, utilizada en algunas vacunas para COVID-19, enseña a las células a reconocer y protegerse contra enfermedades infecciosas.
Uno de los desafíos de la tecnología de ARNm es su necesidad de refrigeración para mantener la estabilidad durante el transporte y almacenamiento. Si el proyecto de UC Riverside tiene éxito, las vacunas de ARNm producidas en plantas y que se puedan ingerir podrían superar este obstáculo, permitiendo su almacenamiento a temperatura ambiente.
El proyecto, financiado por la National Science Foundation, busca demostrar la administración exitosa de ADN que contiene vacunas de ARNm en las células vegetales, la producción de suficiente ARNm por parte de las plantas para que sea comparable a una dosis tradicional, y la determinación de la dosis correcta.
La investigación se enfoca en utilizar los cloroplastos, orgánulos de las células vegetales que convierten la luz solar en energía. Estos actúan como "fábricas solares" que producen moléculas esenciales para el crecimiento de la planta, y representan una fuente sin explotar para la producción de moléculas deseables.
Los científicos están probando este enfoque con espinacas y lechugas, con la meta a largo plazo de que las personas puedan cultivar estas plantas en sus jardines. La colaboración con la Universidad de California en San Diego (UC San Diego) y la Universidad Carnegie Mellon es fundamental, utilizando nanotecnologías para la entrega de material genético a los cloroplastos.
Componentes y Seguridad de las Vacunas Infantiles
Las vacunas infantiles contienen varios componentes diseñados para garantizar su seguridad y eficacia:
- Antígenos: Son la parte activa de la vacuna que estimula la respuesta inmunitaria. Pueden ser virus inactivados (muertos), virus vivos atenuados (debilitados), subunidades virales o fragmentos de bacterias.
- Adyuvantes: Sustancias que ayudan al organismo a generar una respuesta inmunitaria más fuerte.
- Aditivos: Componentes que ayudan a mantener la eficacia de la vacuna durante el almacenamiento.
- Residuos del proceso de producción: Pequeñas cantidades de componentes utilizados durante la fabricación, como antibióticos (neomicina), formaldehído, proteína de huevo o proteína de levadura.
Estos componentes son seguros en las cantidades utilizadas en las vacunas. Por ejemplo, el formaldehído se utiliza para inactivar virus o depurar toxinas, y la cantidad residual es mucho menor que la que el cuerpo produce naturalmente. Los antibióticos se usan para prevenir la contaminación bacteriana durante la fabricación y se reducen a niveles mínimos o indetectables en el producto final.
Las vacunas contra la gripe y la fiebre amarilla se elaboran a partir de huevos, pero las cantidades mínimas de proteína de huevo residuales generalmente no causan reacciones alérgicas. Las vacunas contra el sarampión y las paperas se elaboran a partir de cultivos de células embrionarias de pollo, no en huevos.
Algunas vacunas contienen gelatina para preservarlas o pequeñas cantidades de sales de aluminio para potenciar la respuesta inmunitaria. Estas sales de aluminio se encuentran naturalmente en el medio ambiente y su uso en vacunas ha sido extensamente estudiado sin demostrar riesgos significativos.
Las vacunas no contienen anticongelantes tóxicos como el etilenglicol. Algunas vacunas contra la influenza utilizan polietilenglicol (PEG), que no es tóxico y se usa en diversos productos. El timerosal, un conservante que contiene etilmercurio, fue eliminado de las vacunas infantiles en Estados Unidos hace más de 20 años y no se ha demostrado vínculo alguno con el autismo.
Las vacunas no contienen células fetales. Las líneas celulares utilizadas para el crecimiento de virus se desarrollaron a partir de fetos abortados médicamente en la década de 1960 y no se utilizan nuevos fetos abortados para su producción. Los procesos de purificación eliminan cualquier residuo de tejido fetal.
Conservación de Cepas de Leptospira para Vacunas
El Instituto Finlay ha evaluado la crioconservación a -70°C como método de conservación para cepas de Leptospira interrogans, utilizadas como antígenos en la vacuna antileptospirósica vax-SPIRAL®. Se investigaron nueve variantes de crioprotectores para evaluar la viabilidad, estabilidad de la virulencia y antigenicidad de las cepas.
Los resultados indicaron que el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) al 2.5% y 5%, o leche descremada al 5%, permitió una rápida recuperación de las cepas tras 7 meses de crioconservación sin afectar su virulencia y antigenicidad. El glicerol mostró un efecto variable, siendo ineficiente en algunas concentraciones y cepas.
La vacuna antileptospirósica trivalente vax-SPIRAL® es una suspensión de células inactivadas de tres cepas autóctonas de Leptospira interrogans. Tradicionalmente, las cepas se conservan en medios semisólidos con suero de conejo, lo que garantiza viabilidad por pocos meses y requiere subcultivos frecuentes que pueden disminuir la virulencia. Alternativamente, se aíslan de animales de laboratorio susceptibles para mantener la virulencia.
Sin embargo, la variabilidad de los lotes de suero y la inconsistencia en el crecimiento microbiano hacen que el medio de conservación tradicional no garantice una estabilidad adecuada. La crioconservación con glicerol o DMSO se ha empleado internacionalmente para la conservación de ceparios, ofreciendo buenos resultados en la preservación de viabilidad y virulencia.
Este estudio demuestra la factibilidad de la crioconservación a -70°C con un agente crioprotector apropiado como método de conservación de cepas vacunales de Leptospira, lo que permitiría incrementar la consistencia entre procesos productivos, disminuir costos y minimizar riesgos para el personal.
Desafíos y Estrategias ante la Evolución Viral y la Vacunación
La evolución de los virus, como el SARS-CoV-2, plantea desafíos significativos para la efectividad de las vacunas. La aparición de nuevas variantes, como la británica B.1.1.7, con múltiples mutaciones, ha generado preocupación sobre la posible evasión de la respuesta inmune inducida por las vacunas.
Una estrategia que podría facilitar la aparición de mutantes resistentes a las vacunas es el retraso de la segunda dosis, permitiendo que el virus circule de forma descontrolada y acumule diversidad genética. Esto podría dar al virus la oportunidad de mutar y volverse resistente a los anticuerpos generados por una inmunidad parcial.
Los virus, al multiplicarse, acumulan cambios genéticos. En personas infectadas, donde se generan billones de virus, y con millones de nuevos casos a nivel mundial, la probabilidad de que surjan mutantes resistentes aumenta. Experiencias previas con otros virus, como el de la enfermedad de Marek en aves de corral, demuestran cómo las cepas virales pueden adaptarse a las vacunas e incluso volverse más virulentas.
La velocidad de mutación del virus de la gripe es considerablemente mayor que la del coronavirus, lo que explica la necesidad de actualizar anualmente las vacunas antigripales. Sin embargo, la aparición de variantes del SARS-CoV-2 que escapen a las vacunas es una posibilidad que requiere vigilancia constante.
La tecnología actual de vacunas, enfocada en fragmentos específicos del virus como la proteína de la espícula, podría ser más susceptible a la evasión que la inmunidad generada tras una infección natural completa. La decisión de retrasar la segunda dosis de la vacuna, aunque busca aumentar la cobertura inicial, podría tener el riesgo de seleccionar mutantes resistentes.
Para mitigar estos riesgos, se enfatiza la importancia de limitar la transmisión del virus mediante medidas como el uso de mascarillas, la ventilación, la limitación de contactos y la distancia social. La vacunación, al reducir la circulación del virus, contribuye a contener su avance y la aparición de nuevas variantes.
Es crucial invertir en sistemas de vigilancia epidemiológica para la detección temprana de nuevas variantes, especialmente en regiones con baja cobertura de vacunación. La colaboración internacional y la distribución equitativa de vacunas son fundamentales para prevenir la emergencia y diseminación de variantes preocupantes, garantizando la protección global. La OMS advierte que "nadie está a salvo hasta que todos estemos a salvo".
